一篇miRNA跨界调控研究思路的解析——植物miR159抑制乳腺癌 | miRNA专栏

2012年南京大学张辰宇教授及其团队在Cell Research上发表了一篇名为“Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA”的文章，该研究发现食物中的外源植物miRNA可以调控哺乳动物靶基因的表达，为小RNA研究打开了一扇新的大门。近年来，miRNA的跨界调控（cross-kingdom regulation）逐渐成为领域内的研究热点，今天给大家介绍的文章即为miRNA跨界调控的其中一个实例。

文章2016年发表于Cell Research，主要研究目的是确认西方人类血清中能否检测到植物miRNA以及这些miRNA能否影响与人类疾病（如癌症）相关的基因的表达和生物过程。结果是肯定的。此外，作者通过大量后期验证建立了miR159—TCF7—MYC—Cell Proliferation调控模型。整个研究思路清晰明确，是值得miRNA跨界调控领域研究者学习的文章之一。

在学习文章前，先跟大家简单介绍两个概念：

循环miRNA：可以稳定地存在于血清和血浆等多种体液中的miRNA，可通过细胞外囊泡（EVs）运送到其他细胞及器官中。

细胞外囊泡（EVs）：是细胞主动释放的纳米级膜囊泡。根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体（exosomes）直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g/mL；微粒/微囊泡（microparticles/microvesicles）直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体（apoptotic body/bleb）直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡（large oncosomes）直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。EVs被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体。(本段信息摘自网络资源）

本文中的miR159即为通过EVs运输到其他组织细胞中的循环miRNA。

整体研究思路大致可分为三个部分：

A.确认植物miR159可以在人血清和肿瘤组织中检测到，并且与乳腺癌发展相关；

B.构建miR159在人体内的调控机制；

C.模型验证。

备注：重点学习作者通过大量实验验证调控机制的过程，通过哪些实验，证实了什么。

一．确认植物miR159可以在人血清和肿瘤组织中检测到，并且与乳腺癌发展相关

A.为什么研究miR159而不是其他miRNA？

基于前期对42例II-III期BC患者血清进行Solexa深度测序，并将检测到的miRNA序列与拟南芥和大豆miRNAome比对，鉴定出多种植物miRNA。其中，miR159丰度最高，故而以此为研究目标观察其对BC的影响。

B.怎样验证人血清和乳腺组织中植物源miR159的存在？

作者用qPCR验证了人血清中miR159的存在，并证明了miR159与乳腺癌发展呈负相关。此外，通过超速离心对EVs进行富集，证明人血清中大多数miR159位于EVs中。那么，如何确认血清中miR159是否来源于植物呢？这里要提到植物miRNA和动物miRNA结构上的区别，即植物miRNA的3’末端存在甲基化修饰（2′-O-methylation；哺乳动物miRNA缺乏此种修饰），这对其稳定性至关重要 。这里，研究者采用高碘酸钠氧化处理来确认miR159是植物来源的，并通过原位杂交技术（ISH）证实miR159可在人乳腺肿瘤中检测到且与血清中表达量正相关，从而证明人血清中的miR159能够到达乳腺组织。

C.植物源miR159的可能来源？

人血清中植物miRNA的最可能来源是食物摄取，有意思的是，研究者通过分析几种常见植物中miR159的丰度发现，西兰花中富含miR159，这与其他领域的研究结果不谋而合，至于其中的机制值得进一步探究。

二．构建miR159在人体内的调控机制

既然我们已经证实人类血清和乳腺组织中可以检测到植物源miR159的存在，下面就需要验证miR159是否能够影响BC的生长和增殖，构建完整的调控机制。

A .宏观确定miR159可以影响BC的增殖

细胞扩增实验表明，双链miR159的合成抑制BC细胞的增殖，并且这种抑制作用是剂量依赖型的。

B.机制建立

1.首先，对植物源miR159进行靶基因预测，鉴定其在人类中的靶标。这里结合3种方法进行靶基因预测和鉴定（为提高精确度降低假阳性，很多研究者会使用多种靶基因预测方法寻找miRNA靶基因）：软件DIANA microT v3.0，RNA-Seq以及RISCTRAP。取三者交集中综合评分最高的TCF7（Wnt信号传导途径中TCF / LEF转录因子家族成员之一，是一些肿瘤抑制miRNA的靶标，可以促进BC细胞增殖。）

2.做qPCR验证，证实TCF7与miR159相关。进一步结合荧光素酶报告质粒以及细胞转染实验验证结合位点和对转录活性调控的特异性。然后，通过使用E-box荧光素酶报告基因实验验证miR15 9对TCF7下游靶标MYC细胞活性的抑制。

3.接着，通过Western blot证实miR159能够降低BC细胞中的TCF7和MYC的蛋白水平。

4.最后，利用质粒和miR159共转染MDA-MB-231细胞（BC细胞系）证实miR159通过靶向TCF7从而抑制BC细胞的生长和增殖。从而构建出植物源miR159在人乳腺癌中的调控机制。

三．模型验证

利用MDA-MB-231移植瘤模型来验证miR159是否抑制体内 BC生长。结果显示，miR159处理组肿瘤生长被显著抑制，且miR159的作用依赖于TCF7 的3'UTR区域。

参考文献

1.Lin Z, et al. 2012. Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: evidence of cross-kingdom regulation by microRNA. Cell Research (2012) 22:107-126.

2.Andrew R, et al. 2016. Cross-kingdom inhibition of breast cancer growth by plant miR159. Cell Research (2016) :1-12.

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